Rekombinantní DNA jsou molekuly vytvořené laboratorními technikami genetické rekombinace za účelem kombinace genetického materiálu z více zdrojů. Je to možné, protože molekuly DNA všech organismů mají stejnou chemickou strukturu a liší se pouze nukleotidovou sekvencí v ní.
Creation
Molekulární klonování je laboratorní proces používaný k vytvoření rekombinantní DNA. Je to jedna ze dvou nejpoužívanějších metod spolu s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Umožňuje vám řídit replikaci jakékoli konkrétní sekvence DNA zvolené experimentátorem.
Mezi metodami rekombinantní DNA existují dva zásadní rozdíly. Jedním z nich je, že molekulární klonování zahrnuje replikaci v živé buňce, zatímco PCR zahrnuje in vitro. Dalším rozdílem je, že první metoda umožňuje vyjmutí a vložení sekvencí DNA, zatímco druhá metoda je vylepšena zkopírováním stávající objednávky.
Vektorová DNA
Získání rekombinantní DNA vyžaduje klonovací vektor. Je odvozen z plazmidů nebo virů a je relativně malým segmentem. Výběr vektoru pro molekulární klonování závisí na volbě hostitelského organismu, velikosti DNA, která má být klonována, a na tom, zda mají být exprimovány cizí molekuly. Segmenty lze kombinovat pomocí různých metod, jako je klonování restrikčních enzymů/ligáz nebo sestavení Gibson.
Klonování
Ve standardních protokolech zahrnuje klonování sedm kroků.
- Vyberte hostitelský organismus a klonovací vektor.
- Získání DNA vektoru.
- Tvorba klonované DNA.
- Vytvoření rekombinantní DNA.
- Zavedení do hostitelského organismu.
- Výběr organismů, které ji obsahují.
- Výběr klonů s požadovanými DNA inserty a biologickými vlastnostmi.
Po transplantaci do hostitelského organismu mohou, ale nemusí být exprimovány cizí molekuly obsažené v rekombinantním konstruktu. Exprese vyžaduje restrukturalizaci genu tak, aby zahrnoval sekvence, které jsou nezbytné pro produkci DNA. Používá jej překladatelský stroj hostitele.
Jak to funguje
Rekombinantní DNA funguje, když hostitelská buňka exprimuje protein z rekombinantních genů. Exprese závisí na obklopení genu sadou signálů, které poskytují instrukce pro jeho transkripci. Zahrnují promotor, vazbu ribozomů a terminátor.
Problémy vznikají, pokud genobsahuje introny nebo signály, které fungují jako terminátory pro bakteriálního hostitele. To vede k předčasnému ukončení. Rekombinantní protein může být nesprávně zpracován, složen nebo degradován. K jeho produkci v eukaryotických systémech obvykle dochází v kvasinkách a vláknitých houbách. Použití zvířecích klecí je obtížné kvůli potřebě silné opěrné plochy pro mnohé.
Vlastnosti organismů
Organizmy obsahující molekuly rekombinantní DNA mají zjevně normální fenotypy. Jejich vzhled, chování ani metabolismus se většinou nemění. Jediný způsob, jak prokázat přítomnost rekombinantních sekvencí, je prozkoumat samotnou DNA pomocí testu polymerázové řetězové reakce.
V některých případech může mít rekombinantní DNA škodlivé účinky. To se může stát, když je jeho fragment obsahující aktivní promotor umístěn vedle dříve tichého genu hostitelské buňky.
Použít
Rekombinantní DNA technologie je široce používána v biotechnologii, medicíně a výzkumu. Jeho proteiny a další produkty lze nalézt téměř v každé západní lékárně, veterinární klinice, lékařské ordinaci, lékařské nebo biologické laboratoři.
Nejběžnější aplikace je v základním výzkumu, kde je technologie nezbytná pro velkou část dnešní práce v biologických a biomedicínských vědách. Rekombinantní DNA se používá k identifikaci, mapování a sekvenování genů a k jejich určenífunkcí. Sondy rDNA se používají k analýze genové exprese v jednotlivých buňkách a v tkáních celých organismů. Rekombinantní proteiny se používají jako činidla v laboratorních experimentech. Některé konkrétní příklady jsou uvedeny níže.
Rekombinantní chymosin
Chymosin, který se nachází v abomasu, je enzym potřebný k výrobě sýra. Byla to první geneticky modifikovaná potravinářská přídatná látka používaná v průmyslu. Mikrobiologicky produkovaný rekombinantní enzym strukturně identický s enzymem získaným z telat je levnější a vyrábí se ve větším množství.
Rekombinantní lidský inzulín
Prakticky nahrazený inzulín získaný ze živočišných zdrojů (např. prasat a skotu) pro léčbu diabetu závislého na inzulínu. Rekombinantní inzulín se syntetizuje zavedením genu lidského inzulínu do bakterií rodu Eterichia nebo kvasinek.
Růstový hormon
Předepisováno pacientům, jejichž hypofýza neprodukuje dostatek růstového hormonu k podpoře normálního vývoje. Než se rekombinantní růstový hormon stal dostupným, získával se z hypofýzy mrtvých těl. Tato nebezpečná praxe vedla u některých pacientů k rozvoji Creutzfeldt-Jakobovy choroby.
Rekombinantní koagulační faktor
Jedná se o protein srážející krev, který se podává pacientům s formami hemofilie s poruchami krvácení. Nejsou schopni vyrábětfaktor VIII v dostatečném množství. Před vývojem rekombinantního faktoru VIII byl protein vyroben zpracováním velkého množství lidské krve od více dárců. To s sebou neslo velmi vysoké riziko přenosu infekčních nemocí.
Diagnostika infekce HIV
Každá ze tří široce používaných metod diagnostiky infekce HIV byla vyvinuta pomocí rekombinantní DNA. Test na protilátky používá její protein. Detekuje přítomnost genetického materiálu HIV pomocí reverzní transkripční polymerázové řetězové reakce. Vývoj testu umožnilo molekulární klonování a sekvenování genomů HIV.
