K určení kvalitativního složení mnoha potravinářských produktů se používá xantoproteinová reakce na bílkoviny. Přítomnost aromatických aminokyselin ve sloučenině způsobí pozitivní změnu barvy testovaného vzorku.
Co je to protein
Nazývá se také protein, který je stavebním materiálem pro živý organismus. Proteiny udržují svalový objem, obnovují poraněné a odumřelé tkáňové struktury různých orgánů, ať už jde o vlasy, kůži nebo vazy. Za jejich účasti se tvoří červené krvinky, reguluje se normální fungování mnoha hormonů a buněk imunitního systému.
Jedná se o komplexní molekulu, což je polypeptid s hmotností větší než 6103 d altonů. Proteinová struktura je tvořena aminokyselinovými zbytky ve velkém množství, spojenými peptidovou vazbou.
Struktura bílkovin
Výrazným rysem těchto látek ve srovnání s nízkomolekulárními peptidy je jejich vyvinutá prostorová trojrozměrná struktura podpořená vlivy z různýchstupeň přitažlivosti. Proteiny mají čtyřúrovňovou strukturu. Každý z nich má své vlastní vlastnosti.
Primární organizace jejich molekul je založena na aminokyselinové sekvenci, jejíž struktura je rozpoznána reakcí xantoproteinu na protein. Takovou strukturou je periodicky se opakující peptidová vazba -HN-CH-CO- a radikály postranního řetězce v aminokarboxylových kyselinách jsou selektivní částí. Jsou to oni, kdo v budoucnu určují vlastnosti látky jako celku.
Primární proteinová struktura je považována za dostatečně silnou, což je způsobeno přítomností silných kovalentních interakcí v peptidových vazbách. K tvorbě následných úrovní dochází v závislosti na příznacích zjištěných v počáteční fázi.
Vytvoření sekundární struktury je možné díky stočení aminokyselinové sekvence do spirály, ve které jsou mezi závity vytvořeny vodíkové vazby.
Terciární úroveň organizace molekuly se tvoří, když je jedna část šroubovice superponována na jiné fragmenty se vznikem všech druhů vazeb mezi nimi, s vodíkovou, disulfidovou, kovalentní nebo iontovou sloučeninou. Výsledkem jsou asociace ve formě globulí.
Prostorové uspořádání terciárních struktur s tvorbou chemických vazeb mezi nimi vede ke vzniku konečné formy molekuly nebo kvartérní úrovně.
Aminokyseliny
Určují chemické vlastnosti bílkovin. Existuje asi 20 hlavních aminokyselin,obsažené ve složení polypeptidů v různých sekvencích. Patří sem také vzácné aminokarboxylové kyseliny ve formě hydroxyprolinu a hydroxylysinu, což jsou deriváty bazických peptidů.
Přítomnost jednotlivých aminokyselin jako známka xantoproteinové reakce rozpoznávání proteinů způsobuje změnu barvy činidel, což naznačuje přítomnost specifických struktur v jejich složení.
Jak se ukázalo, všechny jsou to karboxylové kyseliny, ve kterých byl atom vodíku nahrazen aminoskupinou.
Příkladem struktury molekuly je strukturní vzorec glycinu (HNH− HCH− COOH) jako nejjednodušší aminokyseliny.
V tomto případě může být jeden z vodíků CH2- uhlík nahrazen delším radikálem, včetně benzenového kruhu, amino, sulfo, karboxy skupin.
Co znamená xantoproteinová reakce
Pro kvalitativní analýzu proteinů se používají různé metody. Patří sem reakce:
- biuret s fialovým zbarvením;
- ninhydrin za vzniku modrofialového roztoku;
- formaldehyd s červeným zabarvením;
- Fólie s šedočernou sedimentací.
Při provádění každé metody se prokazuje přítomnost proteinů a přítomnost určité funkční skupiny v jejich molekule.
Existuje xantoproteinová reakce na protein. Říká se mu také Mulderův test. Týká se barevných reakcí na proteinech, vcož jsou aromatické a heterocyklické aminokyseliny.
Rysem takového testu je proces nitrace cyklických aminokyselinových zbytků kyselinou dusičnou, zejména adice nitroskupiny na benzenový kruh.
Výsledkem tohoto procesu je tvorba nitrosloučeniny, která se vysráží. Toto je hlavní známka xantoproteinové reakce.
Jaké aminokyseliny se určují
Ne všechny aminokarboxylové kyseliny lze pomocí tohoto testu detekovat. Hlavním rysem xantoproteinové reakce rozpoznávání proteinů je přítomnost benzenového kruhu nebo heterocyklu v molekule aminokyseliny.
Z proteinových aminokarboxylových kyselin se izolují dvě aromatické kyseliny, ve kterých je fenylová skupina (ve fenylalaninu) a hydroxyfenylový radikál (v tyrosinu).
Xantoproteinová reakce se používá ke stanovení heterocyklické aminokyseliny tryptofanu, která má aromatické indolové jádro. Přítomnost výše uvedených sloučenin v proteinu dává charakteristickou barevnou změnu testovacího média.
Jaká se používají činidla
K provedení xantoproteinové reakce budete muset připravit 1% roztok vaječného nebo rostlinného proteinu.
Obvykle používejte slepičí vejce, které se rozbije, aby se dále oddělil protein od žloutku. Pro získání roztoku se 1% proteinu zředí v desetinásobném množství čištěné vody. Po rozpuštění proteinu musí být výsledná kapalina filtrována přes několik vrstev gázy. Tento roztok by měl být skladován na chladném místě.
Reakci můžete provést s rostlinným proteinem. K přípravě roztoku se používá pšeničná mouka v množství 0,04 kg. Přidejte 0,16 l přečištěné vody. Ingredience se smíchají v baňce, která se umístí na 24 hodin na chladné místo o teplotě asi + 1 °C. Po jednom dni se roztok protřepe, poté se přefiltruje nejprve vatou a poté papírovým skládaným filtrem. Výsledná kapalina se uchovává na chladném místě. V takovém roztoku je hlavně frakce albuminu.
K provedení xantoproteinové reakce se jako hlavní činidlo používá koncentrovaná kyselina dusičná. Dalšími činidly jsou roztok 10% hydroxidu sodného nebo amoniaku, roztok želatiny a nekoncentrovaný fenol.
Metodika
Do čisté zkumavky přidejte 1% roztok vaječného proteinu nebo mouky v množství 2 ml. Aby se zabránilo vypadávání vloček, přidá se do ní asi 9 kapek koncentrované kyseliny dusičné. Výsledná směs se zahřeje, výsledkem je, že sraženina zežloutne a postupně zmizí a její barva přejde do roztoku.
Když se kapalina ochladí, přidá se do zkumavky podél stěny asi 9 kapek koncentrovaného hydroxidu sodného, což je pro proces přebytek. Reakce média se stává alkalickou. Obsah zkumavky se zbarví do oranžova.
Funkce
Vzhledem k tomu, že xantoprotein se nazývá kvalitativní reakce na proteiny podpůsobením kyseliny dusičné, pak se test provádí pod přiloženým digestoří. Při práci s koncentrovanými žíravinami dodržujte všechna bezpečnostní opatření.
Během procesu zahřívání může dojít k vysunutí obsahu zkumavky, což je třeba vzít v úvahu při jejím upevňování do držáku a volbě sklonu.
Koncentrovaná kyselina dusičná a hydroxid sodný by se měly užívat pouze pomocí skleněné pipety a gumové kuličky, je zakázáno psát ústy.
Srovnávací reakce s fenolem
Pro ilustraci procesu a potvrzení přítomnosti fenylové skupiny se provádí podobný test s hydroxybenzenem.
Do zkumavky vložte 2 ml zředěného fenolu, poté postupně podél stěny přidávejte 2 ml koncentrované kyseliny dusičné. Roztok se zahřeje, v důsledku čehož zežloutne. Tato reakce je kvalitativní pro přítomnost benzenového kruhu.
Proces nitrace hydroxybenzenu kyselinou dusičnou je doprovázen tvorbou směsi paranitrofenolu a orthonitrofenolu v procentuálním poměru 15 až 35.
Porovnání želatiny
Pro důkaz, že xantoproteinová reakce na protein detekuje pouze aminokyseliny s aromatickou strukturou, se používají proteiny, které nemají fenolickou skupinu.
Do čisté zkumavky naneste 1% roztok želatiny v množství 2 ml. Přidá se do ní asi 9 kapek koncentrované kyseliny dusičné. Výsledná směs se zahřívá. Roztok nežloutne, což dokazuje nepřítomnostaminokyseliny s aromatickou strukturou. Někdy je pozorováno mírné zežloutnutí média kvůli přítomnosti proteinových nečistot.
Chemické rovnice
Xantoproteinová reakce na proteiny probíhá ve dvou fázích. Vzorec prvního stupně popisuje proces nitrace molekuly aminokyseliny pomocí koncentrované kyseliny dusičné.
Příkladem je přidání nitroskupiny k tyrosinu za vzniku nitrotyrosinu a dinitrotyrosinu. V prvním případě je k benzenovému kruhu připojen jeden NO2-radikál a ve druhém případě jsou dva atomy vodíku nahrazeny NO2. Chemický vzorec xantoproteinové reakce je reprezentován interakcí tyrosinu s kyselinou dusičnou za vzniku molekuly nitrotyrosinu.
Proces nitrace je doprovázen přechodem bezbarvé barvy do žlutého tónu. Při provádění podobné reakce s proteiny obsahujícími aminokyselinové zbytky tryptofanu nebo fenylalaninu se také změní barva roztoku.
Ve druhé fázi interagují produkty nitrace molekuly tyrosinu, zejména nitrotyrosin, s hydroxidem amonným nebo sodným. Výsledkem je sodná nebo amonná sůl, která má žlutooranžovou barvu. Tato reakce je spojena se schopností molekuly nitrotyrosinu přejít do chinoidní formy. Později se z ní vytvoří sůl kyseliny dusité, která má chinonový systém dvojných konjugovaných vazeb.
Takto končí xantoproteinová reakce na proteiny. Rovnice dvěfáze je uvedena výše.
Výsledky
Při analýze kapalin obsažených ve třech zkumavkách slouží zředěný fenol jako referenční roztok. Látky s benzenovým kruhem dávají kvalitativní reakci s kyselinou dusičnou. V důsledku toho se barva roztoku změní.
Jak víte, želatina obsahuje kolagen v hydrolyzované formě. Tento protein neobsahuje aromatické aminokarboxylové kyseliny. Při interakci s kyselinou nedochází ke změně barvy média.
Ve třetí zkumavce je pozorována pozitivní xantoproteinová reakce na proteiny. Závěr lze vyvodit následovně: všechny proteiny s aromatickou strukturou, ať už jde o fenylovou skupinu nebo indolový kruh, způsobují změnu barvy roztoku. To je způsobeno tvorbou žlutých nitrosloučenin.
Provedení barevné reakce prokazuje přítomnost různých chemických struktur v aminokyselinách a proteinech. Příklad želatiny ukazuje, že obsahuje aminokarboxylové kyseliny, které nemají fenylovou skupinu nebo cyklickou strukturu.
Xantoproteinová reakce může vysvětlit žloutnutí kůže, když je na ni aplikována silná kyselina dusičná. Mléčná pěna získá stejnou barvu, když se s ní provede taková analýza.
V lékařské laboratorní praxi se tento barevný vzorek nepoužívá k detekci bílkoviny v moči. To je způsobeno žlutou barvou samotné moči.
Xantoproteinová reakce se stále více používá ke kvantifikaci aminokyselin, jako je tryptofan a tyrosin v různých proteinech.
