PCR neboli polymerázová řetězová reakce je sofistikovaná laboratorní technika, která je široce používána v medicíně a dalších vědeckých oborech. PCR diagnostika se najednou stala skutečným průlomem ve vědě.
Popis
Kvantitativní PCR je typ PCR v reálném čase.
Toto je chápáno jako varianta PCR, při které je neustále zaznamenávána kinetika reakce, což umožňuje kvalitativně vyhodnotit obsah specifických nukleotidových sekvencí DNA v komplexní molekulární směsi.
Kvantitativní metoda PCR bude podrobněji diskutována níže.
Podstata analýzy
K diagnostice infekcí se zvláště často používají kulturní a sérologické metody. Podle prvního se stanoví protilátky proti infekčnímu patogenu v krevním séru. Ve druhém je biologický materiál odebraný nemocné osobě použit k výsevu specifického média, které je příznivé pro růst kolonií patogenů. Diagnostika v oboupřípad může trvat dny nebo týdny.
Vyšetření PCR lze provádět s různými biologickými materiály, které se získávají od nemocného člověka. Krev a další patologická, fyziologická a biologická média a tekutiny působí jako vzorky. Můžete udělat PCR výkaly nebo moč.
Atypické a virové infekce jsou nejčastěji diagnostikovány pomocí kvantitativní PCR, protože nemusí být snadné je diagnostikovat kvůli specifické povaze jimi vyvolaného patologického procesu. K určení takových infekcí je potřeba čas, během kterého se začnou v těle vytvářet protilátky, stanovené sérologickými metodami. Ale to je v některých případech nepřijatelné.
Způsob provedení
Metoda PCR - laboratorní detekce infekce ve vzorcích izolovaných od pacienta (in vitro).
K provedení polymerázové řetězové reakce je zapotřebí sada speciálních činidel.
Testovaný materiál se vloží do zkumavek s činidly. Zkumavky jsou umístěny ve speciální aparatuře - PCR zesilovač, který je určen k amplifikaci (zvýšení počtu) požadovaných fragmentů RNA nebo DNA, PCR zesilovač pracuje v cyklickém režimu. V jakémkoli cyklu, pokud vzorky obsahují sekvenci RNA nebo DNA patogenu, pak se v roztoku hromadí stále více kopií částic těchto nukleových kyselin. Můžete určit přítomnost patogenu a jeho množství ve vzorcích.
Typy PCR
Kvalitativní analýza pomocí PCR vám umožňuje získat následující výsledek:
- negativní, když patogen, který nás zajímá, není ve vzorcích nalezen;
- pozitivní, pokud jsou ve vzorcích nalezeny sekvence, které jsou charakteristické pro konkrétní patogen.
S pozitivním výsledkem PCR můžeme s 95% přesností mluvit o přítomnosti diagnostikované infekce. Přesnost PCR setů používaných pro diagnostické účely přitom dosahuje 100 %.
Obvykle 5 % nesprávných výsledků je způsobeno lidským faktorem. Například porušení techniky analýzy a skladování reagencií může významně snížit přesnost studie.
Kvantitativní PCR definuje koncept virové zátěže. Je možné určit, kolik sad patogenní DNA bylo ve vzorcích odebraných pacientovi.
Závažnost infekce je přímo úměrná nárůstu jejich počtu. Můžete také určit úspěšnost terapie ke snížení virové zátěže.
Podání pro PCR biomateriál
Kvantitativní PCR se provádí na klinice převážně ráno. Při návštěvě lékaře bude pacientovi sděleno, co je třeba vzít: škrábání, stěry, moč nebo krev. PCR dokáže detekovat patogeny bez ohledu na úroveň kontaminace materiálu.
Pro pozitivní analýzu je teoreticky vyžadována přítomnost pouze jednoho patogenu ve vzorcích. V praxi se snaží vytvořit ještě příznivější podmínky. K tomu existuje několik doporučení:
- pokud odeberou škrábání nebo výtěr z genitáliíorgánů, musíte se tři dny před studií zdržet intimního styku;
- před analýzou se nemůžete osprchovat antibakteriálními léky ani se umýt;
- tři hodiny před odběrem stěru z močové trubice musíte být trpěliví a nevyprázdnit střeva.
Při darování krve se neřiďte těmito pravidly.
Jak jsou interpretovány výsledky kvantitativní PCR analýzy?
Kvantitativní hodnocení získaných výsledků
V řadě klinických situací se objevuje problém účinnosti léčby a/nebo dynamiky patologického procesu. Takové otázky jsou zvláště důležité při vyšetřování osob s chronickými infekcemi (virus lidské imunodeficience, hepatitida B a C). Při diagnostice vycházejí ze skutečnosti, že akumulace amplikonů (produktů PCR) je úměrná přítomnosti kopií požadovaného genu v analyzovaném vzorku.
Samozřejmě zohlednění výsledků kvantitativní PCR se provádí gelovou elektroforézou se studiem intenzity speciálních PCR signálů. Předpokladem pro správné kvantitativní posouzení získaných výsledků jsou také pozitivní spolehlivé kontrolní vzorky obsahující známý počet kopií požadovaného genu (např. tisíc kopií genu hepatitidy C na jednu PCR reakci). Několik sériových ředění kvantitativní kontroly umožňuje vytvoření kalibračních křivek a používá se k vyhodnocení obsahu klinických genokopií v klinických vzorcích.
V definici kvantitativní PCR bylo klíčovým úspěchem její vytvořenífluorescenční DNA sondy, které se přidávají do reakční směsi současně s jednoduchými primery a umožňují sledovat proces PCR v čase, tedy PCR v reálném čase.
Metodika TaqMan se týká syntézy fluorescenčních sond DNA, které jsou specifické pro střední část amplikonu a mají dvě značky na koncích. Jedna z nich je fluorescenční značka, druhá je zhášecí molekula pro tuto fluorescenci.
Speciální zařízení, které je hybridem fluorimetru a termoblokového zesilovače, provádí konstantní měření fluorescence v každé zkumavce (princip PCR v reálném čase). Po 20-40 cyklech PCR budou pro každý vzorek získány individuální křivky. Počet kopií požadovaného genu, který je obsažen v testovaném vzorku, lze vypočítat z kalibračních křivek s kontrolními vzorky.
Důležitým rysem implementace PCR fluorescenční metodou je také to, že při zohlednění výsledků není potřeba otevírat zkumavky se směsí PCR. To snižuje možnost kontaminace místnosti amplifikačními produkty a není třeba přidělovat speciální pracovní oblasti pro elektroforézu.
Co ukazuje kvantitativní PCR transkript?
Co se objevuje?
Prostřednictvím metody, jako je kvantitativní PCR, se zjišťují kvalitativní změny v genech: inzerce, delece a bodové mutace. Ale u některých dědičných poruch se odpovídající příznaky objevují v reakci na změnu obsahu určitých genů.
DěkujiKvantitativní analýza poskytuje číselný výsledek, nejčastěji v IU / ml. To znamená, že v jednom mililitru testovaného vzorku byl nalezen určitý počet kopií RNA nebo DNA patogenu, měřeno v mezinárodních jednotkách.
V závislosti na rozsahu je diagnostikována závažnost infekce. Krev se obvykle testuje k určení virové zátěže, protože viry se během nemoci volně pohybují v krvi.
Funkce
Kvantitativní PCR v krevním testu má dvě funkce.
- Analýza se provádí za přítomnosti primerů nebo deoxyribonukleosidtrifosfátů, které jsou označeny fluorescenční nebo radioaktivní značkou pro přesné určení obsahu vytvořeného produktu PCR.
- V procesu PCR ukončete reakci dříve, než se objeví příliš mnoho produktů PCR. Je to dáno tím, že v konečné fázi saturace, kdy je produktů PCR hodně, působí jako omezující články této reakce jak samotný enzym, tak substráty. Konec dalšího cyklu PCR za takových podmínek již není charakterizován zdvojnásobením počtu produktů PCR, vyrovnají se nevýznamné kvantitativní rozdíly mezi různými vzorky, které jsou zcela jasně definovány v raných fázích po průchodu řadou reakčních cyklů.
Náklady na diagnostiku PCR
Výzkum PCR má náklady, které závisí na tom, jaký druh infekce bude testován, na metodologii analýzy a testovacím materiálu. Chcete-li určit jednu infekci, budete muset dát dovnitř200-800 rublů. Připočítává se také poplatek za odběr biomateriálu - přibližně 400 rublů.
