Průtoková cytometrie je cytologická výzkumná metoda používaná pro hloubkovou analýzu buněk. Jeho výhodou je, že umožňuje studovat každou buňku samostatně. Tento typ analýzy pomáhá vyhodnotit několik parametrů ve stovkách buněk během několika sekund. V důsledku toho je cytofluorimetrie považována za jednu z nejrychlejších a nejpřesnějších metod analýzy, kterou mají vědci a lékaři v současné době k dispozici.
Princip
Princip průtokové cytometrie je založen na měření rozptylu světla a luminiscence (fluorescence) buněk. Buněčná suspenze prochází jako proud vysokou rychlostí buňkou cytometru, kde je ozařována laserem. Provádí se tam i tzv. hydrodynamické ostření. Jeho mechanismus spočívá v tom, že proud z buňky se studovanými částicemi na výstupu proudí do vnějšího paprsku, který má vyšší rychlost. Výsledkem je, že částice jsou uspořádány v uspořádaném řetězci.
Předbuňky jsou označeny speciálními fluorescenčními barvivy (fluorochromy). Díky nim laserový paprsekvyvolává sekundární záři. Přijímané světelné signály jsou registrovány detektory. Následně jsou informace zpracovány pomocí softwarových algoritmů, které umožňují spočítat jednotlivé buněčné populace, které se v některých kritériích liší.
Výzkum konvenční mikroskopií často nedokáže rozlišit mezi různými buňkami, protože vypadají stejně. Cytofluorimetrie může poskytnout další data (integritu struktury DNA), analyzovat expresi proteinů, přežití buněk.
Vzhledem k tomu, že excitace fluorochromů vyžaduje světelné paprsky s různými vlnovými délkami a také různé typy detektorů, jsou moderní instalace vybaveny několika detekčními kanály (od 4 do 30). Počet laserových zářičů může být od 1 do 7. Složitější zařízení umožňují víceparametrové studie několika vlastností částic najednou.
Výhody a nevýhody
Výhody průtokové cytometrie zahrnují:
- vysoká rychlost zpracování (registrace až 30 tisíc událostí za 1 sekundu);
- možnost studovat velké množství buněk (až 100 milionů ve vzorku);
- Kvantifikace intenzity fluorescenčního světla;
- analýza každé buňky;
- simultánní studium heterogenních procesů;
- automatické oddělení dat podle buněčných populací;
- kvalitní vizualizace výsledků.
Další funkcí této technologie je, žeanalyzovaná částice může být obarvena několika fluorescenčními roztoky. Díky tomu dochází k multiparametrové studii.
Nevýhody zahrnují složitost technického vybavení a nutnost speciální přípravy vzorků.
Cytometry
První zařízení tohoto typu se objevila již v roce 1968 v Německu, ale rozšířila se až mnohem později. V současné době lze všechna zařízení pracující metodou průtokové cytometrie rozdělit do 2 typů:
- zařízení, která měří fluorescenční záření (dvě nebo více vlnových délek), rozptyl světla 10° a 90° (detektor nízkého úhlu a bočního rozptylu);
- zařízení, která kromě měření několika celulárních parametrů automaticky třídí do skupin podle těchto kritérií.
Detektor dopředného rozptylu je určen k určení velikosti buňky a zařízení pro boční rozptyl umožňuje získat informace o přítomnosti intracelulárních granulí, objemovém poměru cytoplazmy a jádra.
Klasické cytometry na rozdíl od světelných mikroskopů neumožňují získat obraz buňky. V posledních letech však byly vyvinuty kombinované přístroje, které jsou schopny spojit možnosti mikroskopu a cytofluorimetru. Budou probrány níže.
Zobrazovací cytometry
Pro nástroje používané v klasické průtokové cytometrii,jeden rys je charakteristický: pokud jsou v populaci analyzovaných buněk registrovány vzácné jevy, pak neexistuje způsob, jak posoudit, co je jejich podstatou. Tyto částice mohou být buď zbytky mrtvých buněk, nebo jejich vzácnou skupinou. V konvenčních zařízeních jsou taková data vyloučena z obecného toku událostí, ale právě ona mohou mít zvláštní hodnotu pro vědeckou a klinickou analýzu.
Nová generace zobrazovacích průtokových cytometrů umožňuje zachytit obraz každé buňky procházející v toku skrz zónu detektoru. Snadno to uvidíte kliknutím na odpovídající oblast diagramu, která se zobrazí na monitoru počítače.
Oblasti použití
Průtoková cytometrie je univerzální metoda, která se používá v mnoha oblastech medicíny a vědy:
- imunologie;
- onkologie;
- transplantologie (transplantace červené kostní dřeně, kmenové buňky);
- hematologie;
- toxikologie;
- biochemie (měření kyselosti uvnitř buňky, studium dalších parametrů);
- farmakologie (vytváření nových léků);
- mikrobiologie;
- parazitologie a virologie;
- oceanologie (studium fytoplanktonu za účelem posouzení stavu vodních útvarů a dalších úkolů);
- nanotechnologie a analýza mikročástic.
Imunologie
Lidský imunitní systém se skládá z široké škály buněk. Průtoková cytometrie v imunologii umožňuje hodnotit jejich strukturu a funkce, tedy provádět morfofunkčníanalýza.
Takový výzkum pomáhá pochopit komplexní povahu imunity. Buněčné fenotypy se mění v důsledku aktivace antigeny, vývoje patologií a dalších faktorů. Cytofluorometrie dokáže oddělit subpopulace imunitních buněk v komplexní směsi a vyhodnotit všechny jejich změny v průběhu času.
Onkologie
Jedním z nejdůležitějších úkolů v onkologii je diferenciace buněk podle jejich typu. Princip analýzy průtokovou cytometrií v onkohematologii je založen na následujícím jevu: když je vzorek ošetřen speciálním fluorescenčním barvivem, váže se na cytoplazmatické proteiny. Po rozdělení v aktivně proliferujících buňkách se jeho obsah sníží na polovinu. V souladu s tím se intenzita buněčné luminiscence sníží dvojnásobně.
Existují další způsoby, jak detekovat proliferující buňky:
- použití barviv vázajících DNA (propidium jodid);
- použití označeného uracilu;
- registrace zvýšené hladiny exprese cyklinových proteinů, které se podílejí na regulaci buněčného cyklu.
