Chromatografie je jednou z metod separace látek. Slouží pro následnou kvalitativní a kvantitativní analýzu fyzikálních a chemických vlastností mikročástic. Variantou této technologie je afinitní chromatografie. Myšlenka diferenciace proteinových sloučenin pomocí vlastnosti molekulární afinity je ve vědě známá již několik desetiletí. Svého vývoje se však dočkal až v posledních letech, po zavedení vysoce porézních hydrofilních materiálů používaných jako matrice. Tato metoda umožňuje řešení jak analytických problémů (separace látek a jejich identifikace), tak preparativních problémů (purifikace, koncentrace).
Essence
Afinitní chromatografie (z latinského slova affinis - „sousední“, „příbuzný“) je založena na afinitních interakcích, což je tvorba vysoce specifických vazeb mezi molekulou spaceru (ligandem nebo afinantem) a cílovou molekulou. Tyto mechanismy jsou v přírodě široce rozšířené (spojení mediátorů nebo hormonů a receptorů, protilátek aantigeny, hybridizace polynukleotidů a další typy procesů). V lékařství se afinitní chromatografie používá pro praktické účely od roku 1951
Součásti jsou odděleny takto:
- pracovní roztok obsahující látku, která má být izolována, prochází sorbentem;
- ligand uložený na matrici sorbentu tuto látku zadrží;
- je koncentrovaný (akumulace);
- extrakce izolované látky ze sorbentu promytím rozpouštědlem.
Tato metoda umožňuje izolovat celé buňky. Rozdíl od tradiční sorpční chromatografie je v tom, že dochází k silné biospecifické vazbě izolované složky na sorbent, který se vyznačuje vysokou selektivitou.
Adsorbenty
Jako adsorbenty se používají následující látky:
- Gelové sloučeniny na bázi agarózy, polysacharidu získaného z agaru. Nejčastěji se používají 3 odrůdy: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) a affi-gel. Posledně jmenovaná kompozice je modifikovaný gel z agarózy a polyakrylamidu. Má větší biologickou inertnost, vysokou chemickou a tepelnou odolnost.
- Silica (silikagel).
- Sklo.
- Organické polymery.
K odstranění mechanických překážek při kontaktu ligandu se používají další látky k jeho oddělení od nosiče (peptidy, diaminy, polyaminy, oligosacharidy).
Zařízení
Zařízení pro afinitní chromatografii zahrnuje následující hlavní jednotky:
- skladovací nádrže pro mobilní fázi (eluent);
- vysokotlaká čerpadla pro střední zásobování (nejčastěji pístové);
- filtr pro čištění eluentů od prachu;
- dávkovací zařízení;
- chromatografická kolona pro separaci směsi;
- detektor pro detekci separovaných složek opouštějících kolonu;
- zapisovače chromatogramů a mikroprocesorová jednotka (počítač).
Aby se snížilo množství rozpuštěného vzduchu, helium nejprve prochází mobilní fází. Pro změnu koncentrace eluentu je instalováno několik čerpadel řízených programátorem. Chromatografické kolony jsou vyrobeny z nerezové oceli (pro zvýšené požadavky na odolnost proti korozi), skla (univerzální varianta) nebo akrylátu. Pro preparativní účely se jejich průměr může pohybovat od 2 do 70 cm. V analytické chromatografii se používají mikrokolony Ø10-150 µm.
Pro zvýšení citlivosti detektorů se do směsi zavádějí činidla, která přispívají k tvorbě látek, které absorbují více paprsků v ultrafialové nebo viditelné oblasti spektra.
Metodika
Existují 2 hlavní typy kapalinové afinitní chromatografie:
- Kolona, ve které je kolona naplněna stacionární fází a proudem přes ni prochází směseluent. K oddělení může dojít pod tlakem nebo gravitací.
- Tenká vrstva. Eluent se pohybuje po ploché vrstvě adsorbentu pod vlivem kapilárních sil. Adsorbent se nanáší na skleněnou desku, keramickou nebo křemennou tyčinku, kovovou fólii.
Hlavní fáze práce zahrnují:
- příprava adsorbentu, fixace ligandu na nosič;
- přívod separační směsi do chromatografické kolony;
- zatížení mobilní fáze, vazba komponenty ligandem;
- náhrada fáze k izolaci navázané látky.
Destination
Afinitní chromatografie se používá k izolaci následujících typů látek (typ použitého ligandu je uveden v závorce):
- analogy enzymatických inhibitorů, substrátů a kofaktorů (enzymů);
- bioorganické látky se známkami genetického odcizení, viry a buňky (protilátky);
- sacharidy s vysokou molekulovou hmotností, monosacharidové polymery, glykoproteiny (lektiny);
- jaderné proteiny, nukleotidyltransferázy (nukleové kyseliny);
- receptory, transportní proteiny (vitamíny, hormony);
- proteiny interagující s buněčnými membránami (buňkami).
Tato technologie se také používá k získání imobilizovaných enzymů a jejich navázání na celulózu umožňuje výrobu imunosorbentů.
Chromatografie DNA-vazebných proteinů
Izolace DNA-vazebných proteinů se provádí pomocíheparin. Tento glykosaminoglykan je schopen vázat širokou škálu molekul. Afinitní chromatografie proteinů této skupiny se používá k izolaci látek, jako jsou:
- faktory iniciace a elongace translace (syntéza molekul nukleové kyseliny a proteinů);
- restriktázy (enzymy, které rozpoznávají určité sekvence ve dvouvláknové DNA);
- DNA ligázy a polymerázy (enzymy, které katalyzují spojení dvou molekul za vzniku nové chemické vazby a podílejí se na replikaci DNA);
- inhibitory serinových proteáz, které hrají důležitou roli v imunitních a zánětlivých procesech;
- růstové faktory: fibroblast, Schwann, endoteliální;
- proteiny extracelulární matrix;
- hormonální receptory;
- lipoproteiny.
Dignity
Tato metoda je jednou z nejspecifičtějších pro izolaci reaktivních sloučenin (enzymů a větších agregátů - virů). Používá se však nejen k izolaci biologicky aktivních látek.
Detekce protilátek v malých množstvích, kvantitativní hodnocení kyseliny polyadenylové, rychlé stanovení molekulových hmotností dehydrogenáz, odstranění určitých polutantů, studium kinetiky aktivace neaktivní formy trypsinu, molekulární struktura člověka interferony – to není celý seznam studií, ve kterých se používá afinita.chromatografie. Použití na klinice je způsobeno jeho výhodami, jako jsou:
- Účinná čisticí schopnostproteiny, polysacharidy, nukleové kyseliny. Mírně se liší svými fyzikálními a chemickými vlastnostmi a ztrácejí aktivitu během hydrolýzy, denaturace a dalších typů úprav používaných v jiných metodách.
- Rychlost separace látek, dynamická povaha procesu.
- K určení disociačních konstant není potřeba speciální čištění enzymů a homogenizace izoenzymů.
- Schopný oddělit širokou škálu látek.
- Nízká spotřeba ligandů.
- Možnost separace látek ve velkých objemech.
- Reverzibilní proces vazby biologických makromolekul.
Tato technika může být kombinována s jinými, aby se vytvořilo dodatečné pole (gravitační, elektromagnetické). To vám umožní rozšířit technické možnosti chromatografie.
Enzymatické inženýrství
Díky této metodě začal aktivní vývoj nového odvětví biotechnologie - enzymového inženýrství.
Afinitní chromatografie pro izolaci enzymů má následující výhody:
- získávání enzymů ve velkém množství v důsledku kratšího času, v důsledku toho - jejich snížení ceny;
- imobilizace enzymů může výrazně rozšířit rozsah jejich aplikace v lékařství a průmyslu;
- Spojení enzymů s nerozpustným pevným nosičem umožňuje studovat vliv mikroprostředí a směr reakcí, které hrají důležitou roli v přírodních a fyziologických procesech.
