Laboratorní diagnostika téměř všech infekčních onemocnění je založena na průkazu protilátek v krvi pacienta, které jsou produkovány proti antigenům patogenu, metodami sérologických reakcí. Do lékařské praxe vstoupili od konce devatenáctého do počátku dvacátého století.
Vývoj vědy pomohl určit antigenní strukturu mikrobů a chemické vzorce jejich toxinů. To umožnilo vytvořit nejen terapeutická, ale i diagnostická séra. Získávají se podáváním oslabených patogenů laboratorním zvířatům. Po několika dnech expozice se krev králíků nebo myší použije k přípravě přípravků používaných k identifikaci mikrobů nebo jejich toxinů pomocí sérologických testů.
Vnější projev takové reakce závisí na podmínkách jejího nastavení a na stavu antigenů v krvi pacienta. Pokud jsou mikrobiální částice nerozpustné, vysrážejí se, lyzují, vážou se nebo imobilizují v séru. Pokud jsou antigeny rozpustné, objeví se fenomén neutralizace nebo precipitace.
Aglutinační reakce (RA)
Sérologický aglutinační test je vysoce specifický. Je to snadné a docelavizuální, k rychlému určení přítomnosti antigenů v krevním séru pacienta. Používá se k testování Vidalovy reakce (diagnostika břišního tyfu a paratyfu) a Weigla (tyfus).
Je založen na specifické interakci mezi lidskými protilátkami (neboli aglutininy) a mikrobiálními buňkami (aglutenogeny). Po jejich interakci se tvoří částice, které se vysrážejí. To je pozitivní znamení. K nastavení reakce lze použít živé nebo usmrcené mikrobiální látky, houby, prvoky, krvinky a somatické buňky.
Chemicky je reakce rozdělena do dvou kroků:
- Specifické spojení protilátek (AT) s antigeny (AG).
- Nespecifické - srážení AG-AT konglomerátů, tj. tvorba aglutinátu.
Nepřímá aglutinační reakce (IPHA)
Tato reakce je citlivější než předchozí. Používá se k diagnostice onemocnění způsobených bakteriemi, intracelulárními parazity a prvoky. Je tak specifický, že lze detekovat i velmi nízké koncentrace protilátek.
K jeho výrobě se používají přečištěné ovčí erytrocyty a lidské červené krvinky předem ošetřené protilátkami nebo antigeny (podle toho, co chce laborant najít). V některých případech jsou lidské červené krvinky léčeny imunoglobuliny. Sérologické reakce erytrocytů se považují za proběhlé, pokud se usadily na dně zkumavky. O pozitivní reakciřekněme, když jsou buňky uspořádány ve formě obráceného deštníku, který zabírá celé dno. Negativní reakce se počítá, pokud se erytrocyty usadily ve sloupci nebo ve formě knoflíku uprostřed dna.
Srážková reakce (RP)
Sérologické reakce tohoto typu se používají k detekci extrémně malých částic antigenů. Mohou to být například proteiny (nebo jejich části), sloučeniny proteinů s lipidy nebo sacharidy, části bakterií, jejich toxiny.
Séra pro reakci se získávají umělou infekcí zvířat, obvykle králíků. Touto metodou můžete získat naprosto jakékoli srážecí sérum. Nastavení sérologických precipitačních reakcí je mechanismem účinku podobné aglutinačním reakcím. Protilátky obsažené v séru se spojují s antigeny v koloidním roztoku a vytvářejí velké proteinové molekuly, které se ukládají na dně zkumavky nebo na substrát (gel). Tato metoda je považována za vysoce specifickou a dokáže detekovat i zanedbatelná množství látky.
Používá se k diagnostice moru, tularémie, antraxu, meningitidy a dalších nemocí. Kromě toho se účastní soudního lékařského vyšetření.
Reakce srážení gelu
Sérologické reakce lze provádět nejen v kapalném médiu, ale také v agarovém gelu. Říká se tomu metoda difúzní srážení. S jeho pomocí se studuje složení komplexních antigenních směsí. Tato metoda je založena na chemotaxi antigenů na protilátky a naopak. V gelu se pohybujík sobě různou rychlostí a při setkání tvoří srážkové linie. Každý řádek je jedna sada AG-AT.
Reakce neutralizace exotoxinu s antitoxinem (PH)
Antitoxická séra jsou schopna neutralizovat působení exotoxinu produkovaného mikroorganismy. Na tom jsou založeny tyto sérologické reakce. Mikrobiologie využívá tuto metodu k titraci sér, toxinů a toxoidu a ke stanovení jejich terapeutické aktivity. Síla neutralizace toxinů je určena konvenčními jednotkami - AE.
Navíc je díky této reakci možné určit druh nebo typ exotoxinu. Toho se využívá při diagnostice tetanu, záškrtu, botulismu. Studii lze provést jak „na skle“, tak v gelu.
Reakce lýzy (RL)
Imunitní sérum, které se dostává do těla pacienta, má kromě své hlavní funkce pasivní imunity také lyzační vlastnosti. Je schopen rozpouštět mikrobiální agens, buněčné cizí elementy a viry, které se dostanou do těla pacienta. V závislosti na specifičnosti protilátek obsažených v séru se izolují bakteriolyziny, cytolysiny, spirochetoliziny, hemolyziny a další.
Tyto specifické protilátky se nazývají „komplement“. Nachází se téměř ve všech lidských tělesných tekutinách, má složitou proteinovou strukturu a je extrémně citlivý na nárůst teploty, otřesy, kyseliny a přímé sluneční záření. Ale v sušeném stavu je schopen udržetjeho vlastnosti lýzy až šest měsíců.
Existují tyto typy sérologických reakcí tohoto typu:
- bakteriolýza;
- hemolýza.
Bakteriolýza se provádí pomocí krevního séra pacienta a specifického imunitního séra s živými mikroby. Pokud je v krvi přítomno dostatečné množství komplementu, výzkumník uvidí lýzu bakterií a reakce bude považována za pozitivní.
Druhou sérologickou reakcí krve je, že se suspenze červených krvinek pacienta ošetří sérem obsahujícím hemolyziny, které se aktivují pouze za přítomnosti určitého komplimentu. Pokud existuje, pak laborantka pozoruje rozpouštění červených krvinek. Tato reakce je široce používána v moderní medicíně ke stanovení titru komplementu (tj. jeho nejmenšího množství, které vyvolává lýzu erytrocytů) v krevním séru a k provedení analýzy fixace komplementu. Tímto způsobem se provádí sérologický test na syfilis – Wassermanova reakce.
Reakce fixace komplementu (CFR)
Tato reakce se používá k detekci protilátek proti infekčnímu agens v krevním séru pacienta ak identifikaci patogenu podle jeho antigenní struktury.
Až do tohoto bodu jsme popsali jednoduché sérologické reakce. RSK je považována za komplexní reakci, protože v ní interagují ne dva, ale tři prvky: protilátka, antigen a komplement. Jeho podstata spočívá v tom, že interakce mezi protilátkou a antigenemse vyskytuje pouze v přítomnosti proteinů komplementu, které jsou adsorbovány na povrchu vytvořeného komplexu AG-AT.
Samotné antigeny po přidání komplementu procházejí významnými změnami, které ukazují kvalitu reakce. Může to být lýza, hemolýza, imobilizace, baktericidní nebo bakteriostatický účinek.
Samotná reakce probíhá ve dvou fázích:
- Tvorba komplexu antigen-protilátka, který není pro vyšetřující vizuálně viditelný.
- Změna antigenu působením komplementu. Tuto fázi lze nejčastěji vysledovat pouhým okem. Pokud reakce není vizuálně viditelná, pak se k identifikaci změn použije další indikátorový systém.
Systém indikátorů
Tato reakce je založena na fixaci komplementu. Hodinu po nastavení RSC se do zkumavky přidají purifikované beraní erytrocyty a hemolytické sérum bez komplementu. Pokud ve zkumavce zůstane nenavázaný komplement, spojí se s komplexem AG-AT vytvořeným mezi ovčími krvinkami a hemolyzinem a způsobí jejich rozpuštění. To znamená, že RSK je záporné. Pokud erytrocyty zůstaly nedotčené, pak je reakce pozitivní.
Hemaglutinační test (RGA)
Existují dvě zásadně odlišné hemaglutinační reakce. Jedna z nich je sérologická, používá se ke stanovení krevních skupin. V tomto případě červené krvinky interagují s protilátkami.
A druhýreakce se nevztahuje na sérologické, protože červené krvinky reagují s hemaglutininy produkovanými viry. Protože každý patogen působí pouze na specifické erytrocyty (kuřecí, jehněčí, opičí), lze tuto reakci považovat za vysoce specifickou.
Zda je reakce pozitivní nebo negativní, poznáte podle umístění krvinek na dně zkumavky. Pokud jejich vzor připomíná obrácený deštník, pak je požadovaný virus přítomen v krvi pacienta. A pokud se všechny erytrocyty vytvořily jako sloupec mincí, pak neexistují žádné požadované patogeny.
Hemaglutinační inhibiční test (HITA)
Jedná se o vysoce specifickou reakci, která umožňuje určit typ, typ viru nebo přítomnost specifických protilátek v krevním séru pacienta.
Jeho podstata spočívá v tom, že protilátky přidané do zkumavky s testovaným materiálem zabraňují ukládání antigenů na erytrocytech, čímž zastavují hemaglutinaci. Toto je kvalitativní známka přítomnosti specifických antigenů pro konkrétní hledaný virus v krvi.
Imunofluorescenční reakce (RIF)
Reakce je založena na schopnosti detekovat komplexy AG-AT pomocí fluorescenční mikroskopie po jejich ošetření fluorochromovými barvivy. Tato metoda se snadno ovládá, nevyžaduje izolaci čisté kultury a zabere málo času. Je nepostradatelný pro rychlou diagnostiku infekčních onemocnění.
V praxi se tyto sérologické reakce dělí na dva typy: přímé a nepřímé.
Přímý RIF se vyrábí zantigen, který je předem ošetřen fluorescenčním sérem. A ta nepřímá spočívá v tom, že nejprve se lék ošetří konvenčním diagnostikem obsahujícím antigeny pro zájmové protilátky a poté se znovu aplikuje luminiscenční sérum, které je specifické pro proteiny komplexu AG-AT, a mikrobiální buňky stát se viditelným pod mikroskopem.
